非洲綠猴腎細胞進(jìn)行細胞傳染的步驟

　　非洲綠猴腎細胞是從正常成年非洲綠猴的腎臟組織中分離建立的。該細胞常作為轉染宿主，用于支原體的檢測。細胞在培養瓶中培養至狀態(tài)良好后灌滿(mǎn)培養基運輸，獲得細胞后用酒精棉球擦拭瓶口消毒，然后在超凈臺中操作；如細胞生長(cháng)至70%-80%，將瓶中的培養基移入無(wú)菌瓶中留作培養使用，保留5-8mL培養基在37℃、5%的CO2的溫箱中繼續培養。細胞培養至90%-100%后，按要求消化傳代；棄去培養基，用無(wú)菌PBS或者其他緩沖液清洗細胞2次，加入適量胰蛋白酶消化（EDTA胰酶），待細胞*脫壁后加培養基吹打混勻，分瓶培養。

　　非洲綠猴腎細胞Vero可能作為表達外源蛋白質(zhì)的有用細胞。作為一種連續傳代的靈長(cháng)類(lèi)細胞，Vero細胞的糖基化酶可能與人類(lèi)的相似。Vero細胞可以大規模培養，已經(jīng)用于脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗的生產(chǎn)。研究了不同條件下Vero細胞的轉染效率，包括脂質(zhì)體和DNA的濃度，細胞數量以及細胞暴露于脂質(zhì)體-DNA混合物中的時(shí)間。通過(guò)檢測報告基因β-gal確定轉染效率，優(yōu)化不同轉染參數，提高了Vero細胞脂質(zhì)體轉染的效率和表達水平。

　　非洲綠猴腎細胞進(jìn)行細胞傳染的步驟：

　?。?）在24孔細胞培養板中，以2.5~7.5×10°細胞/孔接種細胞于0.5ml適當*培養基中。

　?。?）37℃過(guò)夜培養細胞，直到細胞生長(cháng)至50~80%匯和。

　?。?）在滅菌的Eppendorf管中準備下列溶液

　　溶液A：用25u1無(wú)血清培養基稀釋0.25～0.5ug pCDNA3LacZ。

　　溶液B：用25ul無(wú)血清培養基稀釋0.5~6.25ul lipofectAMINE試劑。

　?。?）溫和混合兩溶液，室溫放置15~45分鐘以利于DNA-脂質(zhì)體復合物的形成，與此同時(shí)，用0.5ml無(wú)血清培養基沖洗細胞一次。

　?。?）混合物中加入0.2ml無(wú)血清培養基，溫和混合，加入到漂洗過(guò)的細胞中。

　?。?）37℃二氧化碳溫箱溫育2~24小時(shí)。

　?。?）溫育結束后，不清除轉染混合物直接加入含兩倍濃度血清的培養基。

　?。?）轉染18~24小時(shí)后，換以新鮮的*培養基。

　?。?）48小時(shí)后，收獲細胞或開(kāi)始篩選。