小鼠原代細胞分離實(shí)驗步驟

　　小鼠原代細胞是從小鼠的特定組織中提取出來(lái)的，則可直接得到目的基因不表達的原代細胞模型，且與我們在KO小鼠上的研究具有更好的承接性，從而讓我們想要證實(shí)的實(shí)驗目的更具有說(shuō)服性。KO小鼠的原代細胞還可用于細胞水平的藥物篩選、藥物評價(jià)等方面。原代細胞（Primary cells）是指來(lái)源活體組織，經(jīng)特定分離方法制備而成的初始細胞。原代細胞離體時(shí)間短且不經(jīng)過(guò)永生化過(guò)程，其生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，仍保持原有的遺傳特征，可更好地反映細胞在體內的生長(cháng)狀態(tài)，從而獲得與體內生理功能更接近的數據。

　　小鼠原代細胞分離實(shí)驗步驟：

　　1、小鼠麻醉

　　根據體重計算相應的麻醉劑量并腹腔注射（也可以用異氟烷進(jìn)行空氣麻醉）

　　2、對*麻醉后的小鼠進(jìn)行解剖，打開(kāi)腹腔，找到小鼠下腔靜脈及門(mén)靜脈，使用滯留針插入下腔靜脈，將50-60ml的緩沖溶液一在10-20min內緩慢注射進(jìn)入小鼠血液循環(huán)內，看到小鼠肝臟有明顯腫脹時(shí)剪開(kāi)門(mén)靜脈，完成后改用緩沖溶液二進(jìn)行沖洗。

　　3、沖洗完成后，將小鼠肝臟剪下，轉移至DMEM高糖培養基，用DMEM培養基清洗2-3次后，使用滅菌鑷子將肝臟在培養基內撕開(kāi)，使原代肝細胞從肝臟內流出。

　　4、將分離得到的肝臟細胞過(guò)篩網(wǎng)篩選，過(guò)濾組織碎塊及其他雜質(zhì)，并對細胞混懸液離心，按照一定的離心力得到初步的肝細胞沉淀，此時(shí)的肝細胞中混雜著(zhù)肝臟實(shí)質(zhì)細胞和非實(shí)質(zhì)細胞，需要使用percoll離心液進(jìn)行梯度離心。

　　5、梯度離心后的細胞即為原代肝臟實(shí)質(zhì)細胞，重懸后計數即可用于后續的實(shí)驗，若對細胞純度存疑，也可以進(jìn)行流式測定。