細胞名稱(chēng): NCI-H2170(人肺鱗癌細胞)
細胞別稱(chēng): H2170; H-2170; NCIH2170
細胞貨號: SNL-579
生長(cháng)特性: 貼壁
培養條件: 1640+10% FBS+1% P/S
培養環(huán)境: 37℃;5% CO2;飽和濕度
細胞簡(jiǎn)介: NCI-H2170[H2170]細胞是1989年4月建系的,是從患有鱗狀細胞癌的非吸煙男性患者的肺中分離的細胞系。
細胞正常生長(cháng)形態(tài)照片
1. 貼壁較慢
傳代或復蘇之后,NCI-H2170細胞需要較長(cháng)時(shí)間才能完quan貼壁。起初細胞可能成簇貼壁,隨著(zhù)培養細胞會(huì )慢慢鋪展開(kāi)形成單層細胞。建議將細胞接種至培養器皿后,放進(jìn)培養箱耐心等待48小時(shí)再拿出培養瓶觀(guān)察,更有利于細胞貼壁。
2. 細胞呈島狀/片狀生長(cháng)
這是NCI-H2170細胞的特性,是正?,F象,并不是細胞發(fā)生“聚團",無(wú)需擔心。細胞間連接緊密,在70%~80%密度時(shí)細胞實(shí)際數量其實(shí)很大,此時(shí)需要傳代。
3. 細胞生長(cháng)較慢
80%密度1:2傳代的情況下,傳代周期為6天左右,需耐心培養。維持2-3天換液一次,少觀(guān)察少操作,保持細胞生長(cháng)環(huán)境穩定。建議每次傳代按1:2傳,接種密度不可過(guò)低。
4. 存在漂浮細胞
NCI-H2170細胞培養時(shí)存在部分漂浮的細胞是正?,F象,不影響貼壁細胞生長(cháng)。復蘇和傳代初期,漂浮的細胞可能較多,培養過(guò)程中也會(huì )存在漂浮細胞,當貼壁細胞密度較低時(shí),應該在換液時(shí)將漂浮細胞離心收集并接種回原瓶,這些漂浮細胞仍有可能貼壁。當貼壁細胞較多時(shí),漂浮細胞可以舍棄。
5. 黑點(diǎn)較多
NCI-H2170細胞培養時(shí)背景中可能有較多黑點(diǎn),為細胞代謝產(chǎn)物和細胞碎片,不影響細胞生長(cháng)。若黑點(diǎn)較多可以在換液時(shí)用預熱的PBS輕輕潤洗。
NCI-H2170細胞傳代攻略
1. 準備所需的培養基、胰酶、PBS、離心管、培養瓶以及無(wú)菌槍頭等;(試劑提前預熱)
2. 先盡量吸干凈T25瓶原培養基,再加5mL 常溫PBS輕輕潤洗細胞10-20s,吸走潤洗的PBS;
3. T25瓶加1mL 0.25%胰酶(含EDTA),輕輕晃動(dòng)培養瓶以使胰酶鋪勻瓶底細胞層,將培養瓶放入37度培養箱消化;
4. 消化到細胞明顯回縮,間隙變大,但未完quan脫落時(shí)加2-3mL完quan培養基終止胰酶消化;
Tips:
1. 如果您無(wú)法準確掌控胰酶作用時(shí)間,建議按照下述操作:胰酶首先復溫到室溫,PBS潤洗細胞后,將胰酶加入細胞,放入37度培養箱,然后每隔1min拿出觀(guān)察一次,可用手掌輕拍1-2下培養瓶側邊(請勿用力拍打),如果部分細胞開(kāi)始自然滑落,說(shuō)明細胞消化完成,加完quan培養基終止消化,否則再等1min重復操作直至細胞能夠自然滑落。(保證細胞是被消化下來(lái)的,而不是被強行吹下或拍下的)
5. 混勻細胞并轉移至離心管中,1000rpm離心3min;
6. 在新的培養瓶中加入適量新鮮培養基;(T25推薦10mL,T75推薦20mL)
7. 離心完成后,棄上清,加入適量新鮮培養基輕輕重懸吹散細胞,將細胞懸液均勻接種至培養瓶中,十字法或8字法混勻,然后放入培養箱中繼續培養,注意培養瓶蓋透氣。
Tips:
1. 推薦傳代比例1:2,細胞生長(cháng)至80%密度時(shí)即可傳代。
2. 建議傳代后24h再觀(guān)察細胞,若有漂浮死細胞,可通過(guò)換液去除
3. 控制吹打力度輕柔,吹打次數不能過(guò)多(建議每次重懸吹打不超過(guò)10次)
NCI-H2170細胞凍存攻略
1. 配制程序性?xún)龃嬉?,準備相應數量?jì)龃婀懿⒆龊脴擞洝?/span>
Tips:推薦凍存液配方92%FBS+8%DMSO或92%完quan培養基+8%DMSO
2. 先將細胞按傳代步驟獲得細胞沉淀;
3. 加入適量程序性?xún)龃嬉狠p輕重懸細胞,并將細胞懸液轉移至凍存管中;
4. 將凍存管放入程序性?xún)龃婧?,放?/span>-80℃冰箱過(guò)夜;
5. 轉移凍存細胞至液氮保存并登記細胞保存位置。
Tips:
l 液氮保存24h后建議復蘇一管檢測凍存細胞的活性,若活性合格即可長(cháng)期保存。
l 程序性?xún)龃嬉盒枰浜铣绦蛐詢(xún)龃婧惺褂?,若使用非程序凍存液請按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)處理降溫過(guò)程。
l T25培養瓶長(cháng)滿(mǎn)通??蓛龃?-3管,10cm皿長(cháng)滿(mǎn)通??蓛龃?-4管。
l 凍存密度低將導致復蘇后細胞狀態(tài)不佳。
NCI-H2170細胞復蘇攻略
1. 提前將水浴鍋預熱至37℃,培養基復溫至室溫或37℃,離心機設置好轉速;
2. 將細胞從液氮罐中取出,觀(guān)察管內無(wú)液氮的情況下,捏住管蓋,將細胞凍存部分浸入水浴鍋迅速搖晃,細胞融化至米粒大小冰塊時(shí)終止水浴,融化過(guò)程不超過(guò)2min;
Tips:
l 若液氮或冰箱距離細胞房較遠,細胞需要放在干冰或冰盒上運送至細胞房。
l 凍存管在液氮長(cháng)期保存過(guò)程中難免滲入液氮,取出細胞時(shí)震動(dòng)不要過(guò)大。水浴前一定要觀(guān)察管內是否存在液氮,若有液氮需靜置一會(huì )待液氮完quan蒸發(fā)后再水浴。做好防護,避免凍存管炸開(kāi)導致受傷。
l 水浴時(shí)使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源,避免污染。
3. 直接將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心2min,不同離心機具體轉速會(huì )有差異
4. 離心完成后棄上清,用預熱的培養基緩慢加入凍存管,輕柔重懸細胞后接種至培養瓶中,輕輕混勻后放入培養箱;
5. 復蘇24小時(shí)后觀(guān)察細胞貼壁情況。
Tips:整個(gè)細胞復蘇過(guò)程在盡可能5-10min內完成。
NCI-H2170細胞收貨攻略
l 常溫細胞
1. 收貨后,拆開(kāi)外包裝,用75%酒精消毒T25瓶表面,放37℃培養箱靜置4h以上;
2. 吸走大部分培養基并留10-12 mL,顯微鏡下拍照保存細胞狀態(tài)照片,觀(guān)察細胞密度,若細胞密度大于80%即可按比例傳代(首ci傳代比例建議1:2),若細胞密度低于70%可以留10-12 mL繼續培養至細胞密度80%以上再進(jìn)行傳代培養;
Tips:若收貨時(shí)發(fā)現懸浮細胞較多,應離心收集懸浮細胞并放回原瓶
l 凍存細胞
1. 細胞收貨后盡快開(kāi)箱檢查,若干冰充足可以取出細胞迅速置于-80℃冰箱(2-3天內復蘇)短期保存或液氮中長(cháng)期保存,若干冰完quan揮發(fā)建議立即復蘇細胞并聯(lián)系銷(xiāo)售人員解決;
2. 凍存細胞建議盡快復蘇一管培養檢查,以免超出售后期,復蘇步驟參考復蘇攻略;
3. 復蘇一管細胞出現異常及時(shí)聯(lián)系銷(xiāo)售人員,在專(zhuān)業(yè)技術(shù)支持的指導下進(jìn)行下一步操作;
Tips:
1. 細胞收貨出現漏液、培養瓶破損、干冰完quan揮發(fā)等異常情況時(shí),及時(shí)拍照聯(lián)系銷(xiāo)售人員;
2. 尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細胞內含對應細胞的完quan培養基,可以收集原裝培養瓶?jì)扰囵B基經(jīng)1500rpm離心5min后,取上清于4℃保存用于后續細胞培養;
常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案
細胞密度怎么計算的?
嚴格意義上,細胞密度需要收集細胞懸液計數細胞數量,但在實(shí)際培養過(guò)程中,并不需要為了精確控制細胞數量而消化細胞計數。因此,常用的細胞密度指細胞相對于最大生長(cháng)密度的比值,貼壁細胞可以粗略的用細胞所占培養容器底面積百分比表示,即顯微鏡下觀(guān)察培養容器底部,有細胞的區域占總區域的百分比值,當然這種表達方式受限于單個(gè)細胞生長(cháng)不同密度時(shí)所占面積不同導致并不嚴謹,但也是相當直觀(guān)、簡(jiǎn)便的表現細胞狀態(tài)的一種方式;
NO.2培養過(guò)程中細胞碎片較多怎么處理?
1. 細胞內的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光,這個(gè)屬于細胞自身特性,無(wú)法清除也無(wú)法改變,大部分細胞都會(huì )有這種現象,只是不同細胞顆粒多少有區別,細胞培養體系不適應、營(yíng)養缺乏、滲透壓異常等均可能導致細胞內顆粒增加,建議使用合適的培養條件。
2. 細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞代謝產(chǎn)物,可以先吸走培養基后用PBS潤洗清除,再加新的培養基繼續培養。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細胞密度70-80%左右消化處理細胞,消化完成后加完quan培養基終止消化,混勻細胞,收集細胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min,棄上清。再加5mL PBS重懸細胞,再離心后,用完quan培養基重懸接種到新的培養皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片,如果平時(shí)碎片比較少,傳代時(shí)可以省略PBS重懸的步驟;如果碎片很多,建議PBS多洗幾次。
NO.3細胞具體消化時(shí)間是多久?
每個(gè)客戶(hù)用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣的,不能完quan規定消化時(shí)間,以實(shí)際消化效果和客戶(hù)經(jīng)驗為準。
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