細胞消化不下來(lái)？這份完整解決方案來(lái)了！

小伙伴們在給貼壁細胞傳代的時(shí)候有沒(méi)有遇到細胞消化不下來(lái)的情況呢？有時(shí)候等了10分鐘甚至20分鐘細胞仍巋然不動(dòng)，繼續等待怕消化過(guò)度，暴力吹下又怕對細胞造成機械損傷，可謂進(jìn)退兩難。

小尚為大家總結了細胞難消化的原因，以及對應的處理方式：

（本文僅針對胰蛋白酶，若您使用其他類(lèi)型的細胞解離試劑，可以在評論區留言）

1. 細胞貼壁緊

不同種類(lèi)的細胞貼壁的松緊程度是不一樣的，比如293系列細胞貼壁很松，是晃一晃就可能掉下來(lái)的程度。而MCF10A細胞卻貼壁很緊，可能需要消化5-10min甚至更久才能脫落。在培養一株細胞之前，可以問(wèn)問(wèn)有經(jīng)驗的師哥師姐或者上網(wǎng)查資料確認這株細胞大概消化多久，做到知己知彼百戰百勝。

解決方案：若您培養的細胞貼壁較緊，可以增加消化時(shí)間或胰酶的濃度；加入足量的胰酶至沒(méi)過(guò)細胞；37℃消化；使用含有EDTA的胰酶。

小技巧：

在消化貼壁較緊的細胞有個(gè)小技巧，就是消化到細胞要脫落的時(shí)候先不終止，先吸胰酶輕輕吹下細胞，大部分細胞脫落后再加終止液。貼壁太強的細胞，先加終止有時(shí)候會(huì )很快貼壁回去導致消化其實(shí)細胞已經(jīng)要脫落了，但一加終止液就貼回去的情況。

2. 有殘留血清

血清中的某些蛋白質(zhì)（如α1-抗胰蛋白酶，α2-巨球蛋白）對蛋白酶有強烈的抑制作用。如果PBS清洗不徹*，胰酶將不能發(fā)揮作用。

解決方案：若在消化途中發(fā)現因潤洗不徹*而無(wú)法消化下來(lái)，吸去培養器皿中的胰酶（如果已有部分細胞脫落，將已脫落細胞轉移至離心管），向培養器皿中加入足量PBS重新潤洗30s，棄去PBS再加入新的胰酶重新消化。

3. 胰酶量過(guò)少/濃度低/消化溫度低

有的小伙伴習慣用胰酶潤洗細胞后去掉大部分胰酶，用剩余的胰酶繼續消化，這對于貼壁松的細胞是可以的，但該方法并不適用于貼壁緊的細胞。胰酶量太少無(wú)法將貼壁緊的細胞消化徹*。

胰酶的最適溫度是37℃，有一種常用策略是室溫消化，當溫度低于37℃時(shí)胰酶活性低，室溫環(huán)境消化還可以放在顯微鏡下邊看邊消化，更容易把握消化進(jìn)度。但仍然需要注意這適用于貼壁較松且比較脆弱的細胞，對于貼壁緊的細胞室溫下是很難消化下來(lái)的，甚至可能因消化時(shí)間過(guò)長(cháng)對細胞產(chǎn)生傷害。

常見(jiàn)的胰酶濃度有0.125%，0.25%和0.5%。常規細胞系多用0.25%胰酶，而對胰酶敏感的較脆弱的細胞可使用0.125%胰酶消化。應根據細胞的貼壁特性和胰酶耐受程度，使用不同濃度的胰酶。

解決方案：根據細胞貼壁特性選擇合適的胰酶使用量、濃度和消化溫度。

4. 胰酶失活

胰酶開(kāi)封久了活性會(huì )降低甚至徹*失活，所以小伙伴們可以根據需要將開(kāi)封的胰酶分裝到離心管中，將暫時(shí)不用的部分放在-20℃冰箱冷凍，放在2-8℃冷藏的胰酶也要盡早使用完畢哦。

解決方案：若發(fā)現胰酶開(kāi)封太久，建議使用新的胰酶進(jìn)行消化。

5. 胰酶品牌差異

胰酶通常來(lái)自?；蜇i的胰腺，不同廠(chǎng)家的提取加工工藝不同，所生產(chǎn)的胰酶消化時(shí)間差別較大。

解決方案：從不同廠(chǎng)家獲取胰酶試用裝，找到*適合自己細胞的胰酶品牌。

6. 細胞密度過(guò)大或長(cháng)時(shí)間不傳代

細胞密度過(guò)大，造成細胞擁擠或者堆疊時(shí)細胞將變得更難消化。另外，細胞長(cháng)時(shí)間培養不傳代也有可能使細胞貼壁變緊。

解決方案：若出現上述情況，可增加胰酶的用量，并適當延長(cháng)消化時(shí)間，直到細胞能夠脫落。